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蛋白共提取试剂盒对于体外培养细胞的方法
发布日期：
2018-05-21
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3203
蛋白共提取试剂盒是从培养细胞和动物组织样品同时抽提RNA和DNAzui为快速简单的方法。本试剂盒基于硅胶柱纯化技术，提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提，也无需进行耗时的醇类沉淀，整个过程只需35分钟。该方法得到的RNA可直接用于RT-PCR, Northern blot, poly-A 纯化，核酸保护和体外翻译等实验。
1．根据用量取适当的浆蛋白抽提试剂和核蛋白抽提试剂加入PMSF，使PMSF的zui终浓度为1mM。PMSF需现用现加，若目标蛋白含有丰富的半胱氨酸，可以在两种蛋白抽提液中加入DTT至终浓度0.5mM。
2．对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS洗一遍，用细胞刮刀收集细胞，或用EDTA消化后吹打下细胞（不用胰酶硝化，以免胰酶消化目的蛋白）。500g离心2～3分钟收集细胞，吸尽上清留下沉淀备用。
3．对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，500g离心2～3分钟收集细胞，吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
4．每20ul细胞沉淀加入200ul浆蛋白抽提试剂（2×106个细胞沉淀约20ul或40mg）。
5．用移液器吹打或高速涡旋15秒（可适当延长），必须使细胞沉淀*分散开成单细胞悬液。细胞沉淀分散不*会导致蛋白产量降低。
6．冰浴10分钟。
7．zui高转速剧烈涡旋10秒，4℃12000～16000g离心10分钟。
8．上清即为抽提得到的细胞浆蛋白，立即吸取上清至预冷的样品管中备用，进行后续的PAGE、Western等实验，但蛋白浓度较低，可根据需要进行相应浓缩。
9．沉淀即为细胞核，要*吸尽残余的上清（避免细胞浆蛋白的污染），加入50-100ul核蛋白抽提试剂。
10．用移液器吹打或高速涡旋15秒（可适当延长）至沉淀*分散，冰浴10分钟。
11．zui高转速剧烈涡旋10秒，4℃12000～16000g离心10分钟。
12．立即吸取上清至预冷的样品管中，此即为抽提得到的细胞核蛋白。可进行后续实验或-70℃冻存。
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